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本帖最后由 hztop17 于 2013-5-22 16:53 编辑
蛋白质是粮食的重要检验指标之一,它的测定通常利用经典的凯氏定氮法。凯氏定氮法会用到的仪器有：定氮仪又叫做蛋白质测定仪。凯氏定氮仪分为全自动和半自动定氮仪。全自动一次完成加碱、加硼酸、蒸馏，氨气吸收整个过程，加硼酸和加碱的体积以及蒸馏和吸收过程的时间都可以自行设定。不需要再进行人工操作，方便。但是对于对实验结果要求很高的用户来说，还是推荐使用半自动凯氏定氮仪。因为半自动凯氏定氮仪可以自行控制每个环节，包括时间、试剂等，能够很好的掌握整个测定蛋白质的过程。国标中对凯氏定氮法检测方法的介绍比较简单,操作中应注意的事项也没有介绍,这就给刚从事此项检验的人员造成了一些困难,如果个别步骤操作不当将直接影响检验结果的准确性。还有人认为凯氏蒸馏装置存在一定的不安全性,个别人不敢操作。笔者根据多方学习和多年的检验经验,对蛋白质测定操作中不易掌握的个别步骤进行了总结,并对检测装置稍加改装,提高了检验的安全性和试验结果的准确性,对掌握蛋白质的检测有着良好的借鉴作用,现介绍如下(操作步骤参照GB/ T 5009. 522003) 。
1 水蒸气发生器的安全改装
水蒸气发生器的烧瓶瓶塞上一般有两个导气管,一个是通往反应室的导气管,还有一个安全导气管。在蒸馏过程中,通往反应室的导气管的弹簧夹是放开的,水蒸气发生器烧瓶内气压基本能保持安全,但蒸馏完成后,通往反应室的导气管要马上用弹簧夹夹死,水蒸气发生器烧瓶又不能及时降温,就会使水蒸气发生器烧瓶内压迅速增加,安全管太短沸水容易沸出伤人,沸水溅到电炉上易损坏电炉,安全管太长易使水蒸气发生器烧瓶内压增大,水蒸气发生器烧瓶容易爆裂伤人。
为了防止沸水溢出、水蒸气发生器烧瓶爆裂,在水蒸气发生器烧瓶的胶塞上再打一个孔,插上一段玻璃管(放气管) ,玻璃管插入瓶塞深度以露出胶塞即可,切不可没入水蒸气发生器烧瓶液面以下,上端接上一小段胶管(改装后水蒸气发生器蒸馏烧瓶胶塞有安全管、导气管、放气管各一根) ,夹上弹簧夹,蒸馏时将放气管夹子夹死,停止蒸馏时,夹死通向反应室导气管的弹簧夹后马上放开放气管弹簧夹,起到平衡蒸馏烧瓶内压的作用,这样既可防止沸水从安全管溢出,又能防止水蒸气发生器烧瓶的爆裂。
2 注意事项
2. 1 凯氏烧瓶和试样要求
称取0. 1～5. 0g 样品。如果称1g 以上的样品,就需要用大一些的凯氏烧瓶,最小500mL , 800～1000mL 的更好,这样的凯氏烧瓶对于缩短氨化时间,加热的均匀性和完全氨化效果较好。样品应是均匀的,若是固体样品应事先研细,液体样要混合均匀。样品放入凯氏烧瓶时,不要黏附在瓶颈上,万一黏附可用少量水缓慢冲下,以免被检样消化不完全,导致结果偏低。
2. 2 H2 SO4 和K2 SO4 的添加量
有机物分解需要浓H2 SO4 ,加入量应根据试样中有机物的种类、含量来定,如果试样脂类含量高,则加H2 SO4 多。为了提高分解温度,要适量添加K2 SO4 ,K2 SO4 添加太多,则温度太高,生成的硫酸氢铵也会分解,放出氨而造成损失; K2 SO4 添加太少, 分解温度过低, 消化时间过长。K2 SO4 和H2 SO4 的添加比例是: 1g 样品, K2 SO4 ∶H2 SO4 =7g∶12mL 这种比例在国内外都使用,是公认的。国标中还有一种比例:1g 样品, K2 SO4 ∶H2 SO4 = 6g∶20mL 。试样在消化冷却后呈固态则表明K2 SO4 用量过大,或H2 SO4 用量不足。
2. 3 催化剂的选择
用作催化剂的有Hg、HgO、Se 、硒化合物、CuSO4 、TiO2 , Hg 与HgO 有毒但结果好, Se 与CuSO4 得到结果基本是一致的, TiO2 的结果偏低;对于一般谷物的消化基本都采用CuSO4 作催化剂,CuSO4 作催化剂的好处是在蒸馏氨时可作为碱性反应的指示剂。
2. 4 指示剂的选取
1 份甲基红乙醇溶液(1g/ L) 与5 份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/ L) 临用时混合。也可以用2 份甲基红乙醇溶液与1 份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。无论用哪种混合指示剂一定要在临用时混合。在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。
2. 5 NaOH的加入量
蒸馏前加入足量浓度为40 %的NaO H ,只有加入足量的NaO H 才能使氨气全部溢出被硼酸吸收,防止样液中氨气逸出,否则测定值偏低。
2. 6 热源的强度
消化时热源的强度和消化速度与试样是否完全氨化关系很大,即使盐类K2 SO4 加得多,如果热源弱,也是没有意义的,热源过强导致氨损失,使氨回收率低,另外凯氏瓶的容量大小,颈部的粗细和长短等,也与热源的强度有关。在整个消化过程中,要保持和缓的沸腾,使火力集中在凯氏烧瓶底部,火力不能过猛,否则消化液爆沸使样品黏附在定氮瓶壁上,黏附在定氮瓶壁上的蛋白质在没有硫酸存在的情况下,造成氮的损失。
2. 7 消化的程度
消化液变为兰绿色澄清透明,说明消化完全。消化时,如不能呈透明溶液,可将凯氏烧瓶放冷后,加入30 %过氧化氢2～3mL ,促使氧化,继续消化30min 即可。
2. 8 吸收液的浓度
一般用硼酸作为吸收液,浓度在3 %以上可将氨完全吸收,为保险起见一般用4 %的硼酸。
2. 9 蒸馏效果的判定
氨是否完全被蒸馏出来,移开氨吸收瓶,用p H试纸测定蒸馏出的液滴,如果不为碱性则说明氨蒸馏彻底。 |
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